一(yi)、原理(li)差異

免(mian)(mian)疫組(zu)(zu)化(hua)：融合了免(mian)(mian)疫學(xue)原(yuan)理(li)（抗(kang)(kang)原(yuan)抗(kang)(kang)體特(te)異性(xing)(xing)(xing)結合）和組(zu)(zu)織學(xue)技(ji)術（組(zu)(zu)織的取材、固定(ding)(ding)、包埋、切片、脫蠟、水化(hua)等），通過化(hua)學(xue)反應使標記抗(kang)(kang)體的顯(xian)色劑(ji) (熒光素、酶、金(jin)屬(shu)離子、同(tong)位(wei)素)顯(xian)色，來對(dui)組(zu)(zu)織（細胞(bao)）內抗(kang)(kang)原(yuan)(多肽和蛋(dan)白(bai)質)進行定(ding)(ding)位(wei)、定(ding)(ding)性(xing)(xing)(xing)及相對(dui)定(ding)(ding)量的研(yan)究(主要(yao)是定(ding)(ding)位(wei))。樣(yang)本(ben)是細胞(bao)或(huo)組(zu)(zu)織，稱為免(mian)(mian)疫組(zu)(zu)織化(hua)學(xue)技(ji)術(immunohistochemistry)或(huo)免(mian)(mian)疫細胞(bao)化(hua)學(xue)技(ji)術(immunocytochemistry)。要(yao)在顯(xian)微鏡下(xia)觀(guan)察結果(guo)，可能出(chu)現膜陽(yang)性(xing)(xing)(xing)、質陽(yang)性(xing)(xing)(xing)和核陽(yang)性(xing)(xing)(xing)。

免(mian)疫(yi)印跡（immunoblotting）又稱(cheng)蛋白質印跡（Western blotting），是根據(ju)抗原抗體的特異性結合(he)檢測(ce)復雜樣(yang)(yang)品中(zhong)的某種蛋白的方法。先要進行SDS-PAGE，然后將分離開的蛋白質樣(yang)(yang)品用(yong)電(dian)轉(zhuan)儀轉(zhuan)移到固相載體上，而后利用(yong)抗原-抗體-標(biao)記物顯色(se)來檢測(ce)樣(yang)(yang)品，可以(yi)用(yong)于(yu)定(ding)性和半(ban)定(ding)量。結合(he)化學發光檢測(ce)，可以(yi)同時(shi)比(bi)較多個樣(yang)(yang)品同種蛋白的表達(da)量差異。

二、實驗目的

免疫組化 IHC / IF / ICC ——蛋白(bai)定位(wei)檢測(ce)分析

1.定位(wei)較直(zhi)接準確

2.定性靈敏度高

3.半定量(liang)（高質量(liang)染色，背景淺，特異性強(qiang)的切片；表達量(liang)較多的蛋白）

免疫印(yin)跡試驗 Western blot

1.測樣品內蛋白含量(liang)，定量(liang)較IHC更(geng)準(zhun)確

2.定性和間(jian)接定位，敏感性遠(yuan)遠(yuan)低于免疫組化技術

三、實驗準備

（一）免(mian)疫組化實驗(yan)樣本
（新鮮，固定方式，充分脫水，防脫處理）

1.取材(cai)新鮮(xian)，及時固定：防(fang)止離體太久而發生組織自(zi)溶長(chang)菌(jun)，抗原擴散或(huo)丟失，易保存

2.固(gu)定液：

（1）醛(quan)類：形(xing)態結構(gou)保(bao)存好，穿透性強，組(zu)織收(shou)縮少；醛(quan)基與蛋白(bai)氨(an)基交(jiao)聯(lian)形(xing)成羧甲基，使(shi)抗(kang)原決定(ding)簇(cu)不能充分暴(bao)露，需要抗(kang)原修復

- 4%多聚甲(jia)醛（常用，適用大多數組織(zhi)，細胞）

- 10%福爾馬林/甲醛(quan)（常用，脂(zhi)肪類，脊髓類）

-戊 二 quan（微細(xi)結構(gou)保存好，用于電鏡(jing)）

（2）醇類：穿透性強，脫水性強，易引起組織收(shou)縮，使蛋白變性作用輕，抗原可流失。

-乙醇(chun)，甲(jia)醇(chun)

（3）其他(ta)固(gu)定劑

-丙酮，抗原保存性好，脫(tuo)色(se)性更強，常用于部(bu)分細胞爬片

-混(hun)合固(gu)定劑(ji)，Bouni 液，Zamboni液，AAF液等

固(gu)定時間(jian)：醛類(lei)建議(yi)24小時以內(nei)，醇類(lei)，丙(bing)酮2小時以內(nei)，組織大小厚度(du)略有差異

3. 充分脫水：保存時間長(chang)，防止裂(lie)片，保持組織結(jie)構，防止冰切形成冰晶

4. 防脫處(chu)理：防止掉片，多聚(ju)賴氨酸防脫切片，明膠和硫酸鉻鉀處(chu)理等

免(mian)疫組化切片類型

1.石蠟切(qie)片(pian)

易保存（干燥(zao)低溫4~8℃保存），厚度3~6um，結構形態好，需要抗原修復，抗原活性偏(pian)低（烤片，固(gu)定等）

2.冰凍切片

不易保存(cun)（-80℃保存(cun)半年），厚度(du)10~20um，形態結構較差(cha)，抗原(yuan)活性(xing)高(gao)，不一定抗原(yuan)修復(fu)，胞(bao)內核內抗原(yuan)需打孔

冰凍切片是否需要(yao)抗原(yuan)修復？如何固定？

（1）不(bu)能及時切片(pian)染色觀(guan)察：可(ke)選擇固(gu)定（24小時內）后(hou)切片(pian)，需要修復(fu)；或馬上包埋切片(pian)后(hou)固(gu)定（10 min以內），可(ke)修復(fu)可(ke)不(bu)修復(fu)

（2）馬上(shang)切(qie)片(pian)染色觀(guan)察的，可不(bu)固(gu)定，可不(bu)修復

3.細胞(bao)爬片(pian)（貼(tie)壁，半貼(tie)壁，懸(xuan)浮(fu)）

單(dan)層細胞，均勻爬片，選擇合(he)適的固定方式保(bao)證細胞形態，細胞周期(qi)同一化，不(bu)需要(yao)修復---培養皿/平板 ---蓋(gai)玻片爬片

（二）實驗準備-WB實驗樣本

1.新(xin)鮮制備，低(di)溫(wen) 裂(lie)解 （全蛋白，不包括核抽提(ti)、亞細胞器分(fen)離(li)等(deng)）

2.裂解液，蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑

3.研(yan)磨（組織(zhi)），液氮（小體(ti)積組織(zhi)），超聲波(bo)（細菌/細胞）

4.跑膠，蛋(dan)白定量

注意事項(xiang)：

1.防止(zhi)蛋白降解，磷酸化(hua)蛋白防止(zhi)去(qu)磷酸化(hua)

2.濃(nong)度低(di)蛋白(bai)量少不易檢(jian)測，濃(nong)度高裂解液粘稠不易吸取

3.分泌型蛋(dan)白(bai)，無血清細胞(bao)培(pei)養收集上清，TCA沉淀富(fu)集