1、western blot 的(de)優點

答：靈敏(min)，可達(da)(da)ng級，用Ecl顯色法(fa)理(li)論上(shang)可達(da)(da)pg 級。方(fang)便(bian)，特異性高。

2、為什么(me)我的細胞提取液中沒有目標蛋白？

答：原因有很多：

a) 你的細胞中不表達(da)這種(zhong)(zhong)蛋(dan)白質(zhi)，換一種(zhong)(zhong)細胞；

b) 你(ni)(ni)的細(xi)胞(bao)中的蛋(dan)白質被降解掉(diao)了，你(ni)(ni)必須加入PMSF，抑制蛋(dan)白酶活性；

c) 你的抗體不能識別(bie)目標蛋白，多看(kan)看(kan)說明，看(kan)是(shi)否有問題。

3、我(wo)的細胞提取液有(you)的有(you)沉淀，有(you)的很清亮，為什么(me)呢(ni)？

答：a) 有沉淀可能(neng)因為你(ni)的(de)蛋白沒有變性完，可以適當(dang)提高(gao)SDS 濃(nong)度，同時將樣(yang)品(pin)煮沸時間延長， b) 也不排除你(ni)的(de)抗原(yuan)濃(nong)度過(guo)高(gao)，這時再加入適量(liang)上樣(yang)緩沖液即可。

4、我做(zuo)的蛋白質分子量很小(xiao)（10KD），請問怎(zen)么做(zuo)WB？

答：可以選擇0.2μml的膜，同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉移。其他按步驟即可。

5、我(wo)的目的帶(dai)很弱，怎么加強？

答：可以加大抗原上樣量。這是最主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。

6、膠片背景很臟(zang)，有什么解(jie)決(jue)方法(fa)？

答：減少抗原上樣量，降低一抗濃度，改變一抗孵育時間，提高牛奶濃度。

7、目標帶是(shi)空(kong)白，周圍(wei)有背景，是(shi)為什么？

答：你的一抗濃度較高，二抗上HRP 催化活力太強，同時你的顯色底物處于一個臨界點，反應時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現象"。將一抗和二抗濃度降低，或更換新底物。

8、我(wo)的膠片是一片空(kong)白(bai)，是怎么回事？

答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現在一抗和抗原制備上。

a) 二抗的HRP 活(huo)性太強，將底物消(xiao)耗光；

b) ECM底物中(zhong)H2O2，不穩定，失(shi)活；

c) ECL底物(wu)沒覆蓋到相應位(wei)置；

d) 二抗失活。

9、我在顯(xian)影液中(zhong)顯(xian)影1分鐘(zhong)和5分鐘(zhong)后,底片(pian)漆黑一片(pian),是什么原因呢?

答：a) 可能是紅燈造成的, 膠片本來就被曝光了，可以在黑暗的情況下操作.看是否有改善.；b) 顯影時間過長。

10、DAB好還是ECM好？

答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；ECM結果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。要看你實驗的情況。

11、抗(kang)原檢測出的分(fen)子量(liang)比資料(liao)上的大，是怎么回事(shi)？

答：a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時間延長，可以打開二聚體。b)蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等。

12、蛋白轉移(yi)不到(dao)膜上，但膠上有(you)，同時(shi)Marker 轉上去了，為什么？

答：可(ke)能是：a)樣品濃度過低；b)轉移時間不夠。

13、磷酸化抗體(ti)的檢測樣本(ben)制備時是否一定要加NaF等？

答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。

14、要(yao)驗(yan)證某(mou)個細胞上有無該蛋白的(de)存在，需要(yao)做(zuo)免疫(yi)組化和(he)western blot試驗(yan)嗎(ma)？做(zuo)這兩(liang)個試驗(yan)時的(de)一抗(kang)和(he)二抗(kang)可以共用嗎(ma)？

答：① 免疫組化可以用來進行定位，但是不能精確定量，而且有時會有假陽性，不易與背景區分；Western blot可以特異性檢測某個蛋白質分子，進行定量，但是不能定位。

② 兩種實驗的一抗有時候不能通用，公司的產品說明一般都會說明可以進行什么實驗，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

15、做Western Blot時，提取蛋(dan)(dan)白(bai)后凍存（未(wei)加(jia)蛋(dan)(dan)白(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑(ji)），用的(de)博士德的(de)一(yi)抗(kang)，開始還有點(dian)痕跡，現在越來越差(cha)，上樣量已加(jia)到120μg，換(huan)了個santa cloz的(de)一(yi)抗(kang)仍不行(xing)。是什(shen)么(me)原因(yin)？蛋(dan)(dan)白(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑(ji)單加(jia)PMSF行(xing)嗎？

答：懷疑是樣品問題(ti)，可能(neng)是：

1，樣(yang)品不能反復凍融(rong)；

2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查Western Blot過程， 提高一抗濃度。對于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾種蛋白酶抑制劑。

16、細胞水平要做western blot，多少細胞提的蛋白(bai)夠(gou)做western blot？

答：一般5×10^6就足夠了。

17、同一(yi)樣(yang)品(pin)能(neng)同時提RNA又提蛋(dan)白么？這樣(yang)對western blot有無影響？

答：能，沒有問題。

18、同一(yi)蛋白(bai)樣品(pin)能(neng)同時(shi)進行兩種因子(zi)的Western Blot檢測嗎？

答：當然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。

19、如(ru)果目標(biao)蛋白(bai)是膜蛋白(bai)或是胞漿蛋白(bai)，操作需要注意什(shen)么？

答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑要溫和得多，這時最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

20、我的樣品的蛋白含量很低，每微(wei)升不到1微(wei)克，但是在(zai)轉膜時經常會(hui)發(fa)現(xian)只有一部(bu)分蛋白轉到了膜上，就是在(zai)轉膜后染膠發(fa)現(xian)有的孔(kong)所有的蛋白條(tiao)帶都(dou)在(zai)，只是顏色變淡(dan)了，有什么辦法可以解(jie)決(jue)？

答：你(ni)可以(yi)加大(da)上樣量，沒有問題(ti)，還有轉移時你(ni)可以(yi)用減少電流延長時間(jian)，加20％甲醇(chun)。